THEME I : NOUVELLES METHODOLOGIES R.M.N. 1D ET

2D DANS LES CRISTAUX LIQUIDES
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  • I) Développement des expériences R.M.N. "CRASY" (1992-1994)

    Les expériences "CRASY" (Correlated Random lAbel SpectroscopY) consistent à simplifier l’analyse des spectres proton en milieu orienté en deutérant statistiquement la molécule à étudier. Les différents isotopomères du mélange statistique sont ensuite détectés par R.M.N. 1H découplé du deutérium (découplage inverse). L'information dipolaire associée à chaque isotopomère peut être ensuite triée et étalée sur les deux domaines de fréquence d'une expérience R.M.N. bidimensionnelle. Pour cela, une séquence 2D multi-impulsion Double Quantum proton (90°-tm-180°-tm-90°-t1-90°-t2) avec découplage deutérium a été mise au point et testée expérimentalement dans le cas de l'acétone deutérée statistiquement à environ 90 %. Les résultats obtenus pour cette molécule dissoute dans un cristal liquide nématique fortement orienté (ZLI 1167) montrent que l'analyse d'un spectre complexe du second ordre de type A3A'3 peut être ramenée à l'analyse simple de deux sous-spectres de type A2 (soit au total deux doublets), ce qui permet une mesure directe des constantes de couplages dipolaires 1H-1H de la molécule (dans cet exemple, les couplages DHH géminé et vicinal) (cf. Fig. 1 et 2).

    La séquence d'impulsions proposée permet de découpler ou non les interactions proton-deutérium. Dans ce second cas, il est alors possible de visualiser et de mesurer dans la dimension F1 les couplages dipolaires proton-deutérium, fournissant ainsi une manière originale et simple pour accéder à ces informations hétéronucléaires. Par ailleurs, nous avons pu également observer et mesurer sur le spectre double quantum un effet isotopique secondaire 2DH(D) de 16 ppb (effet géminé) du deutérium sur le déplacement chimique des protons de l’acétone.

    Fig. 1 : Spectres 1D proton de l'acétone deutérée à 90%, avant (a) et après (b) découplage 2H (T=310 K).

    Fig. 2 : Spectres 2D proton double quantum de l'acétone d6 90% pour deux délais tm.

    En conclusion, les possibilités analytiques de cette technique sont remarquables, cependant elle suppose de pouvoir deutérer statistiquement la molécule étudiée, ce qui n'est pas toujours facile à réaliser.

     

    II) Simplification de spectres R.M.N. en milieu orienté par réduction cohérente de l'Hamiltonien de spin : les expériences 2D SMI-COSY (1992-1994)

     

    Le spectre proton d'une molécule orientée dans un cristal liquide est généralement du second ordre et donc particulièrement complexe à analyser. Pour le simplifier, il est nécessaire de réduire l'amplitude des couplages dipolaires 1H-1H (sans toutefois les annuler) à l'aide de séquences multi-impulsions (SMI) particulières. Une SMI adaptée au besoin de la R.M.N. dans les cristaux liquides se doit de transformer l'Hamiltonien de spin classique en un Hamiltonien moyen qui s'écrit à l'ordre zéro :

    = KcsHcs + HJ + KDHD

    Hcs, HJ et HD sont respectivement les Hamiltoniens de déplacement chimique, de couplage scalaire et de couplage dipolaire, Kcs et KD sont des facteurs de réduction variables associés aux termes Hcs et HD de l'Hamiltonien. On parle alors de réduction cohérente de l'Hamiltonien de spin.

    Comme les SMI utilisées en solide ne répondent pas aux exigences de la R.M.N. dans les cristaux liquides (annulation des DHH), trois nouvelles SMI telles que Flip-Flop-16 (notée FF-16) ont été développées théoriquement puis testées expérimentalement au laboratoire (cf. Fig. 3).

    Fig. 3 : Représentation schématique de la séquence multi-impulsions Flip-Flop-16. Pva symbolise une impulsion d'angle a et de phase v. tl et th sont les délais entre impulsions.

    Pour éliminer la plupart des difficultés techniques liées à la gestion d'une SMI pendant la période d'acquisition (t2), ces séquences ont été implantées pendant la période d’évolution libre (t1) d'une expérience 2D COSY (COrrelated SpectroscopY)

    Fig. 4 : Représentation schématique d'une SMI implantée dans la séquence 2D COSY.

    (cf. Fig. 4). Les séquences 2D ainsi créées et notées SMI-COSY permettent de réduire efficacement les interactions de couplage dipolaire et de déplacement chimique dans la dimension F1. L'intérêt essentiel d'une SMI telle que FF-16 réside dans le choix des facteurs de réduction agissant sur les termes de déplacement chimique et de couplage dipolaire en fonction de l'angle d'impulsion a, et/ou du timing de la SMI (rapport des délais entre impulsions, th/[2tl+th]). En choisissant judicieusement les paramètres de la séquence, nous pouvons alors annuler ou inverser le signe des couplages dipolaires 1H-1H. Diverses études expérimentales utilisant FF-16 ont été réalisées sur des systèmes de spins simples (A, A2,A3) en milieu nématique (cf. Fig. 5)

     

     

    Fig. 5 : Spectre 2D FF-16 COSY d'un système de spins de type A2. L'angle d'impulsion de la SMI est de 70°, et le rapport des délais est égal à 3/4. (solvant nématique).

    Fig. 6 : Evolutions de la projection n1 de l'expérience 2D FF-16 COSY (système A2) en fonction de l'angle a (a) et du rapport des délais tl et th (b) (solvant cholestérique).

    Notons enfin que cette méthode est actuellement la seule susceptible de simplifier (dans de bonnes conditions expérimentales) les spectres de molécules dissoutes dans les solvants thermotropes cholestériques, puisque, dans ce cas, la technique VAS (Variable Angle Spinning) ne peut être utilisée efficacement (cf. Fig. 6).

    Pour vérifier le potentiel de cette technique, nous avons étudié différents systèmes de spins complexes du second ordre obtenu dans une mésophase nématique ou cholestérique.

    Nous avons ainsi montré que des systèmes de spins du second ordre (AB, A3B ou ABC) pouvaient être transformés en systèmes du premier ordre plus plus simples à analyser (cf. Fig. 7). Malgré un certain nombre de limites plus instrumentales que théoriques, les paramètres spectraux (ni et Dij) déterminés sur les spectres réduits permettent de calculer un jeu de paramètres très proches de ceux du spectre 1D non modifié.

    Enfin, nous avons constaté des divergences non négligeables entre les valeurs des coefficients de réduction prévues par la théorie (hypothèse des impulsions infiniment courtes) et les valeurs expérimentales.

    Fig. 7 : Transformation d'un système A3B en un système A3X, plus simple à analyser.

    Cet effet, lié à la durée finie des impulsions de la SMI, a été étudié et quantifié en utilisant le formalisme des tenseurs irréductibles. Les valeurs calculées à partir de l’expression des coefficients de réduction prenant en compte la durée finie des impulsions sont alors conformes aux résultats expérimentaux.

    III) Simplification des spectres hétéronucléaires en milieu anisotrope (1996)

    Récemment, la chimie du Fluor-19 a connu un développement important compte tenu de son rôle dans la détermination des mécanismes biochimiques. C'est pourquoi, l'étude de molécules monofluorées en milieu cristal liquide peut se révéler potentiellement intéressante. Evidemment, les solutions consistant à modifier isotopiquement le Fluor ne peuvent être appliquées ici, et seules des approches "purement" R.M.N. sont possibles. Pour cela, nous avons développé une application hétéronucléaire de l'expérience 2D SMI-COSY pour simplifier les spectres dipolaires X-1H (IS). L'Hamiltonien moyen (ordre zéro) sous lequel évolue le système s'écrit dans ce cas :

  • = H + Kcs(H+ H) + [KcsH+ H + KDH]
  • Parallèlement à l'élimination des couplages dipolaires 1H-1H (SS), les couplages scalaires et dipolaires hétéronucléaires, X-1H (IS), du système sont réduits de la même manière qu'un déplacement chimique. En effet, la forme des Hamiltoniens associés à l’interaction de couplage HIS est formellement comparable à celle de l'Hamiltonien de déplacement chimique Hcs.

    Fig. 8 : Spectre 2D MREV-8 COSY fluor-19 d'un système ABCDX (X=19F) simulé à 235,3 MHz à l'aide du programme de simulation NMRSIM.

    Fig. 9 : Spectre expérimental 2D FF-16 COSY fluor du 1,3-dichloro-4-fluorobenzène (système ABCX, X=19F) dans le ZLI 1167 (T=310 K).

    Les Figures 8 (simulation) et 9 (expérience) montrent comment une expérience 2D SMI-COSY hétéronucléaire permet de transformer un spectre du second ordre de type ABCDX ou ABCX en un spectre du premier ordre symétrique de 2n raies visibles si aucun recouvrement se produit. Ainsi, il devient possible dans le cas de molécules monofluorées par exemple, d'obtenir un spectre fluor du premier ordre symétrique, à partir duquel les constantes de couplage dipolaire 1H-19F sont déterminées beaucoup plus facilement. Ces constantes sont ensuite utilisées pour simuler le spectre proton de la molécule. Comme dans le cas des applications homonucléaires, la propriété de réduction cohérente associée à la séquence multi-impulsion FF-16 permet de modifier de manière "continue" le spectre hétéronucléaire en fonction de l'angle d'impulsion (a) et/ou du timing de la séquence (cf. Fig. 10).

    Fig. 10 : Évolution simulée de la projection F1 d'un système ABWX (où W=X=19F) en fonction de l'angle d'impulsion a. Noter que pour a=120°, DFH = 0 Hz.

    Enfin, la possibilité d'annuler totalement les couplages hétéronucléaires conduit à une application originale : l'utilisation de la séquence 2D SMI-COSY comme technique de découplage "indirect", notamment quand les techniques classiques ne donnent pas de résultats expérimentaux satisfaisants

    IV) Discrimination et analyse des spectres d'énantiomères en milieu anisotrope chiral par R.M.N. multidimensionnelle (1995-1996)

    L'analyse de spectres (proton) d'énantiomères orientés dans un milieu anisotrope chiral est généralement très complexe dans la mesure où nous observons la superposition de deux spectres R.M.N. dipolaires associés aux deux isomères et présentant une multitude de transitions. Il est donc essentiel dans une première étape d'identifier les transitions appartenant à l'un ou l'autre des deux énantiomères, notamment en série racémique. Pour y parvenir, l'utilisation d'expériences de corrélation 2D de type HOHAHA s'est révélée extrêmement efficace, en simplifiant considérablement l'identification des transitions et par conséquent l'analyse des spectres proton. Comme en témoigne la Figure 11, l'analyse du spectre de corrélation 2D HOHAHA proton du (±) 3,3,3-trichloroépoxypropane (TEP) obtenu dans un solvant cholestérique (solvant anisotrope chiral) permet de séparer sans ambiguïté toutes les transitions associées à chacun des isomères du mélange (système ABC).

    Fig. 11 : Spectre 2D HOHAHA du (±) TEP enregistré dans un solvant cholestérique à 310 K.

    En effet, il est possible de retrouver sur les colonnes ou les lignes du spectre 2D, l'ensemble des signaux de chaque énantiomère. On s'aperçoit alors que les transitions appartenant à l'un ou l'autre des énantiomères sont toujours les mêmes. Ceci est dû aux multiples transferts de cohérence créés par la séquence au sein d'un même système de spins et relayés via les couplages dipolaires proton-proton. Les deux isomères du mélange n'ayant pas de couplages spin-spin en commun, ils ne sont donc pas corrélés entre eux.

    Dans un même ordre d'idée, nous avons mis en évidence qu'une expérience 2D (n-1) quanta permettait à la fois de séparer et d'identifier les transitions appartenant au spectre de chaque énantiomère. De plus, le spectre 2D fournit dans la dimension (n-1) quanta (projection F1) un spectre plus simple à analyser (moins de transitions visibles), duquel nous pouvons extraire l'ensemble des paramètres spectraux utiles associés aux deux isomères R et S de la molécule chirale.

    Autour de cette R.M.N. multi-quanta, une application originale a été proposée pour l'analyse de molécules possédant par exemple un hétéroatome magnétiquement actif comme le fluor-19 (spin I=1/2) ou le deutérium. Nous avons ainsi montré que le spectre proton n quanta d'une molécule chirale (de n protons) monofluorée se caractérisait par deux doublets dipolaires proton-fluor (JHF + 2DHF) distincts associés aux deux énantiomères.

    Fig. 12 : Spectre 2D n quantum proton d'un système fictif AMX (X=19F) simulé avec le programme NMRSIM.

    Les corrélations proton-proton sont distribuées sur chaque composante du doublet et permettent sans difficulté d'identifier dans la dimension F2 du spectre les transitions à un quantum appartenant à chaque énantiomère. Pour illustrer ce concept, le spectre simulé 2D double quantum proton de deux systèmes AMX fictifs indépendants est présenté sur la Figure 12.

    Dans la phase cristal-liquide PBLG (cf. Thème III), il est possible de calculer les paramètres d’ordre orientationnel (matrice de Saupe) de deux énantiomères en combinant les résultats obtenus par R.M.N. du proton et du carbone-13 couplé des protons. Cependant dans le cas de mélanges racémiques, il est impossible de relier directement les informations (Dij) carbone-13 et proton pour chaque énantiomère. Pour lever en partie ces difficultés, la solution proposée consiste à utiliser des expériences 2D de corrélation hétéronucléaire (HECTOR). Pour s’en convaincre, le spectre de corrélation hétéronucléaire carbone-proton de l'acide (±) 2-bromopropanoïque (BPA) dissous dans la phase PBLG/CD2Cl2 est présenté sur la Figure 13. Sur cet agrandissement (centré au niveau des signaux du méthyle de la molécule), nous observons que chaque signal carbone-13 (dimension F2) est corrélé à l'un ou l'autre des spectres protons localisés dans la dimension F1.

    Fig. 13 : Spectre 2D corrélation carbone-proton associé au groupe méthyle du (±) BPA (T=300 K)

    Par conséquent, il devient très simple d'attribuer les diverses signaux des différents carbones et protons pour chaque énantiomère, puis d'extraire toutes les informations spectrales utiles. Sur cet exemple, il est possible d'obtenir deux jeux cohérents de quatre couplages dipolaires pour chaque isomère, et non plus deux fois deux jeux de couplages dipolaires indépendants non corrélés.

     En combinant les résultats précédents à ceux issus de l'analyse d'un spectre 2D de type HOHAHA, on peut alors envisager de déterminer de manière cohérente l'ensemble des couplages dipolaires résiduels proton-proton et carbone-proton associés à chaque énantiomère d'une molécule chirale.

    V) Nouvelles séquences R.M.N. bidmensionnelle adaptées aux noyaux de spin I=1 en milieu orienté : application à l'analyse énantiomérique par R.M.N. du deutérium en abondance naturelle (1997-1998)

     Très récemment, nous avons montré que la R.M.N. du deutérium en abondance naturelle pouvait être utilisée efficacement pour visualiser des énantiomères dans les cristaux liquides chiraux (cf. Thème II). Cette technique possède intrinsèquement un fort potentiel analytique puisque nous bénéficions des avantages de la R.M.N. en abondance naturelle (observation simultanée de tous les sites de discrimination chirale, disparition des couplages dipolaires 2H-2H, aucune modification isotopique) et de la détection d'une interaction R.M.N. (interaction quadrupolaire) très sensible à l'ordre orientationnel des molécules (cf. Thème II). Cependant, lorsque le nombre d'isotopomères deutérés présent dans le mélange est trop important, les spectres 1D 2H-{1H} en abondance naturelle deviennent extrêmement complexes à analyser (superposition de doublets quadrupolaires indépendants, recouvrement de raies), ce qui rend a priori la méthode peu attrayante. Pour simplifier l'analyse de ces spectres 1D, il est nécessaire d'éclater l'information sur deux domaines de fréquence (exp. 2D), tout en cherchant à corréler les deux composantes de chaque doublet quadrupolaire

    Fig. 14 : Schéma impulsionnel des expériences 2D de corrélation de type "double-quantum" (a), "écho" (b) et "COSY" (c) pour des spins I=1.

    Nous avons donc développé une nouvelle classe d'expériences de corrélation bidimensionnelles adaptées aux noyaux de spin I=1 baptisée QUOSY (QUadrupolar Ordered SpectroscopY). Trois différents types d'expériences permettant de séparer les signaux quadrupolaires de chaque isotopomère ont été mises au point : les expériences 2D de type "double-quantum" (cf. Fig. 14a) notées Q-DQD (a=90°), de type "écho" (cf. Fig. 14b) notées Q-résolue (a=180° : refocalisation des déplacements chimiques) et d-résolue (a=90° : refocalisation des couplages quadrupolaires) et de type "COSY" (cf. Fig. 14c) notées Q-COSY, (a=180° : pas de signaux diagonaux) et Q-COSY PH (a=45°/135° / mode écho-antiécho : obtention d'une surface phasable). Les différentes expériences 2D proposées ont été étudiées au moyen du formalisme des opérateurs de spin cartésiens simplifié, simulées à l'aide du programme "NMRSIM", puis testées expérimentalement.

    Pour illustrer les potentiels analytiques de ces expériences R.M.N. 2D, les spectres 2D deutérium Q-DQD et Q-COSY phasée du pentan-1-ol perdeutéré dissous dans la phase PBLG/CHCl3 sont présentés sur les Figures 15 et 16. Nous constatons que ces expériences 2D permettent de corréler sans ambiguïté les deux composantes de chaque doublet quadrupolaire du spectre et donc de séparer le sous-spectre de chaque isotopomère du mélange. Notons au passage que les deutériums énantiotopes sur les groupes méthylènes prochiraux en position a et b sont nettement discriminés (deux doublets quadrupolaires visibles) (cf. Thème III).

    Fig. 15 : Spectre 2D double-quantum du du pentan-1-ol-d12 obtenu pour un délai t = 1,45 ms (T=298 K).

    Fig. 16 : Spectre 2D Q-COSY PH symétrisée du pentan-1-ol-d12 (mode écho-antiécho) (T=298 K).

    Les expériences 2D Q-COSY et Q-résolue se sont révélées particulièrement adaptées à la R.M.N. du deutérium en abondance naturelle. En effet, les signaux de corrélation sont obtenus après une seule acquisition alors que toute la polarisation initiale (Iz) est transformée en aimantation observable, ce qui optimise leur sensibilité. De plus, pour ces deux expériences, les signaux diagonaux sont éliminés, ce qui augmente la lisibilité des spectres et nous autorise à basculer le spectre de 45° (opération de tilt) après une double transformée de Fourier. Cette transformation est similaire à celle réalisée avec les expériences 2D J-résolue utilisées pour les spins I=1/2, cependant dans notre cas, elle permet d'éliminer les couplages quadrupolaires dans la dimension F2 et d'extraire le spectre deutérium de chaque isotopomère du mélange. Pour l'expérience 2D Q-COSY, nous bénéficions d'un facteur d'échelle (un facteur 2) dans la dimension F2 après tilt. Cette situation est une conséquence du théorème de la "projection des sections croisées". A titre d'exemple, le spectre 2D Q-COSY deutérium en abondance naturelle du (±) pent-1-yn-3-ol obtenu après tilt est présenté sur la Figure 17. Le spectre a été enregistré sur un spectromètre de 400 MHz (9,4 T) après 18 heures d'acquisition sur un mélange racémique (100 mg). L'analyse des différentes colonnes du spectre nous permet de séparer et d'identifier le sous-spectre deutérium de chaque isotopomère du mélange.

    Nous avons enfin montré que les expériences 2D Q-COSY deutérium en abondance naturelle pouvaient être utilisées pour analyser le spectre de mélanges enrichis malgré la très faible quantité d'énantiomère minoritaire. L'exemple présenté sur la Figure 18 prouve qu'il est possible de visualiser les deux énantiomères (notamment au niveau du groupement méthyle) avec un temps d'expérience raisonnable (20 à 30 heures sur un spectromètre de 9,4 T), alors que la quantité d'énantiomère minoritaire (S) est de 3.510-4 mol, soit 1.610-7 mol pour les isotopomères deutérés correspondant au méthyle (3 isotopomères deutérés équivalents). Avec les moyens disponibles, la précision sur la mesure de l'excès énantiomérique sur les spectres 2D Q-COSY est estimée actuellement à environ 10%, ce qui permet déjà des études quantitatives intéressantes.

    Fig. 17 : Spectre 2D Q-COSY tilté 2H-{1H} en abondance naturelle du (±) pent-1-yn-3-ol (T=298 K).

    Cette nouvelle technique de R.M.N. pour la visualisation d'énantiomères constitue doncune approche très prometteuse, capable de fournir rapidement aux chimistes des résultats analytiques importants, notamment la possibilité ou non de visualiser les deux énantiomères et de mesurer un éventuel excès énantiomérique sans modifier chimiquement la molécule chirale.

    Par ailleurs, elle permet en une expérience unique de visualiser tous les isotopomères deutérés du mélange, et par conséquent de définir in fine le site deutéré le plus intéressant de la molécule (au niveau de la discrimination chirale et du rapport signal sur bruit (S/N)) pour mesurer un excès énantiomérique. L'identification du ou des meilleurs sites de discrimination chirale dans la molécule nous permet alors d'envisager (ou pas) l'introduction sélective d'un deutérium sur l'un de ces sites, et donc d'améliorer considérablement la précision sur la mesure des excès énantiomériques.

    Fig. 18 : Colonne extraite du spectre tilté 2D Q-COSY 2H-{1H} en abondance naturelle et associée au méthyle du (±) but-3-yn-2-ol enrichi en isomère S (25mg/75mg).